北京2022年5月8日 /美通社/ -- 2022年5月2日，陸道培醫(yī)院陸佩華教授（第一作者和共同通訊作者）團(tuán)隊、河北森朗生物科技有限公司（以下簡稱"森朗"）李建強(qiáng)教授（共同通訊作者）團(tuán)隊（劉瑩，共同第一作者）、北京大學(xué)人民醫(yī)院黃曉軍教授（共同通訊作者）合作在血液科國際權(quán)威期刊Blood（IF=23.63）發(fā)表了題為Naturally Selected CD7 CAR-T Therapy without Genetic Manipulations for T-ALL/LBL: First-in-human Phase I Clinical Trial 的研究論文。
急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL) 和T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤(T-cell lymphoblastic lymphoma, T-LBL)是具有高度侵襲性的T系惡性腫瘤。由于正常T細(xì)胞和惡性T細(xì)胞之間共有的抗原性，目前仍然缺乏針對T細(xì)胞惡性腫瘤的獲批CAR-T療法。
CD7在T-ALL/LBL T細(xì)胞表面高度表達(dá)，是潛在的CAR-T治療靶點。靶向CD7的免疫療法可能會受到T細(xì)胞自相殘殺機(jī)制（fratricide）的影響。因此，在既往研究中曾采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和蛋白沉默表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)靶向CD7的CAR-T細(xì)胞。但是，基因編輯技術(shù)會使得CD7 CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)成本增加。此外，使用患者自體T細(xì)胞制造CD7 CAR-T細(xì)胞仍然具有一定難度。雖然供者來源或通用型CD7 CAR-T是一種選擇，但尋找合適的供體、異體CAR-T在體內(nèi)擴(kuò)增能力及持續(xù)時間等問題仍有待解決。
針對上述難題，本研究開展探索，使用了森朗生物研發(fā)的患者或供者來源的，無需額外進(jìn)行CD7基因編輯或蛋白質(zhì)表達(dá)阻斷的"自然選擇（Naturally Selected）"CD7 CAR-T細(xì)胞(NS7CAR)的新產(chǎn)品，并在1項針對T-ALL/LBL患者的1期臨床試驗中首次探索了NS7CAR療法在人體內(nèi)的安全性和有效性。
臨床前研究
研究者使用三種不同的方法制造了靶向CD7的CAR-T細(xì)胞并比較它們的功能：1)NS7CAR：通過用7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)總T細(xì)胞，然后對其進(jìn)行"自然選擇"的細(xì)胞培養(yǎng)方式獲得；2)Neg7CAR：由天然存在的CD7陰性T細(xì)胞（占CD3+T細(xì)胞的3%-10%）用7CAR進(jìn)行純化和轉(zhuǎn)導(dǎo)后進(jìn)行生產(chǎn)；3)KO7CAR：通過將7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)到使用CRISPR/Cas9RNP敲除CD7基因的總T細(xì)胞進(jìn)行制造。
在2周的培養(yǎng)期間內(nèi)，NS7CAR的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)顯著低于Neg7CAR和KO7CAR的擴(kuò)增倍數(shù)；然而，有87.3%的NS7CAR是活細(xì)胞，使得進(jìn)一步研究成為可能。在收獲時，NS7CAR組中平均92.4%的T細(xì)胞表達(dá)7CAR分子，顯著高于Neg7CAR或KO7CAR（p<0.0001)。在7CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)三天后，NS7CAR組中的T細(xì)胞發(fā)生了從CD7+CAR-到CD7-CAR+的快速而顯著的表型轉(zhuǎn)變。
一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，盡管NS7CAR組中的T細(xì)胞在體外培養(yǎng)后用流式未檢測到CD7的表面表達(dá)，但使用RT-PCR和WesternBlot檢測到了顯著的CD7mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。與此同時，在Neg7CAR或KO7CAR細(xì)胞中未觀察到CD7mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)。這些結(jié)果表明，盡管NS7CAR表達(dá)CD7mRNA和蛋白質(zhì)，但它們在免疫學(xué)上是CD7陰性的，并由于CD7CAR的抗原隱蔽/細(xì)胞內(nèi)隔離作用而逃脫了自相殘殺的細(xì)胞殺傷機(jī)制。這一點在隨后的臨床研究中，在CAR-T回輸后第28天檢測到患者體內(nèi)NS7CAR中CD7mRNA的表達(dá)持續(xù)存在而被進(jìn)一步證實。此外，相比Neg7CAR和KO7CAR，NS7CAR包含較多的CD8+亞群和中央記憶表型亞群。
在體外抗白血病實驗中，NS7CAR和KO7CAR對CCRF-CEM細(xì)胞均表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，并釋放高水平的IFN-γ和TNF-α，但Neg7CAR細(xì)胞的相應(yīng)數(shù)值較低。在動物實驗中，在CAR-T注射后的前兩周內(nèi)，NS7CAR和KO7CAR均可顯著降低小鼠模型中的白血病負(fù)擔(dān)。這些數(shù)據(jù)證明了無需額外的基因編輯，直接由7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的總T細(xì)胞產(chǎn)生有效的CD7CAR-T的可行性。因此，陸道培醫(yī)療團(tuán)隊在1期臨床試驗中使用NS7CAR-T細(xì)胞，進(jìn)一步探索其有效性和安全性。
臨床研究
‖研究設(shè)計
本研究是1項開放、單臂的1期臨床研究，目的是評估NS7CAR對CD7+R/R T-ALL或T-LBL患者的安全性和療效。入組標(biāo)準(zhǔn)包括年齡在2至65歲之間的患者，既往至少接受過兩線治療后失敗，且CD7表達(dá)≥80%的患者。在NS7CAR輸注后的第28天后，根據(jù)醫(yī)生的考量和患者的意愿，允許進(jìn)行鞏固性異體造血干細(xì)胞移植。
‖患者基線數(shù)據(jù)
此次臨床試驗，共入組和回輸20名復(fù)發(fā)或難治性(R/R) T-ALL/T-LBL患者，其中包含14名R/R T-ALL患者及6名R/R T-LBL患者。3名患者為Ph陽性或ETP-ALL高危亞型；11名患者存在高危突變或基因融合。5名患者在入組前接受過移植。患者接受了中位數(shù)為4.5線的治療。入組時，17名患者的骨髓腫瘤細(xì)胞比例中位數(shù)為21.49%；有3名T-LBL患者髓內(nèi)未見腫瘤細(xì)胞。分別有5位T-LBL和4位T-ALL患者有髓外病灶，其中3名有中樞受累。
‖臨床產(chǎn)品制備及回輸
研究應(yīng)用了來源于患者或其移植供者的NS7CAR產(chǎn)品。對于未接受過異基因移植的患者，使用自體CAR-T細(xì)胞；對于入組時為移植后復(fù)發(fā)狀態(tài)的患者，在對患者進(jìn)行綜合評估后確定使用患者自體或移植供者來源的CAR-T細(xì)胞。所有患者的NS7CAR產(chǎn)品均成功制備（自體來源，n=18；供者來源，n=2），中位轉(zhuǎn)染效率為95.10%。NS7CAR產(chǎn)品有更多的CD8+亞群，中位CD4/CD8比例為0.42。在Day0，分別3、16和1名患者接受了低劑量（0.5×106/kg）、中劑量（1-1.5×106/kg）或高劑量（2×106/kg）的單次NS7CAR回輸。
‖療效及安全性
NS7CAR展現(xiàn)出了良好的安全性和耐受性。1名患者未出現(xiàn)CRS;18名患者的CRS≤2級，僅有一名患者出現(xiàn)3級CRS。2名患者發(fā)生1級ICANS。
同時，NS7CAR在臨床試驗中展現(xiàn)了令人振奮的好療效。在Day28時，16/17（94.12%）的骨髓受累患者實現(xiàn)了MRD陰性完全緩解；3名僅有髓外病灶的T-LBL患者也繼續(xù)保持了髓內(nèi)CRi的狀態(tài)。在9名有髓外病灶的患者中，5名在中位時間29天時達(dá)到髓外CR。兩名有巨大縱隔腫物（>7cm）的患者在第29天分別達(dá)到髓外部分緩解（PR）和疾病穩(wěn)定（SD），其中PR患者在第104天時，其髓外病灶進(jìn)一步縮小。兩名有中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的患者也分別在第15天和第28天達(dá)到CR。
至研究截止日期（2021年10月25日），患者的中位隨訪時間為142.5天，最長達(dá)311天。6/20名患者在CAR-T細(xì)胞回輸后未接受額外的抗白血病治療或移植，其中4人在54天的中位時間保持無疾病進(jìn)展。在回輸后中位時間57.5天，10名CR患者接受了鞏固性橋接移植；移植后中位隨訪時間為210天，7/10名CR患者在移植后保持MRD陰性并持續(xù)生存。兩名患者因個人原因出組，出組時均處于CR。一名患者進(jìn)行了二次移植，發(fā)展為3級aGvHD，隨后去世。有4名未達(dá)到CR或CR后復(fù)發(fā)的患者接受了挽救性移植并全部達(dá)到CR。
‖NS7CAR的細(xì)胞動力學(xué)
NS7CAR擴(kuò)增起始于回輸后中位數(shù)4.5天。CAR中位峰值拷貝數(shù)為1.37×105copies/μg DNA，達(dá)到峰值的中位時間為19天。在末次隨訪時，NS7CAR+DNA中位持續(xù)時間為90天；在移植后中位時間39.5天，12/14名患者仍可通過qPCR檢測到水平較低的NS7CAR+DNA。對于未橋接移植的6名患者，CAR-T細(xì)胞在末次隨訪中仍可檢測到，中位持續(xù)時間為48.5天。用流式檢測的NS7CAR中位峰值比例為67.76%，最高比例達(dá)84.71%；中位峰值時間為17天。
NS7CAR回輸后，患者外周血中惡性和正常CD7+細(xì)胞的最顯著減少發(fā)生在回輸后中位時間第7天。在CAR-T擴(kuò)增高峰，每位患者的T/B/NK細(xì)胞（不包括CAR+ 和白血病T細(xì)胞）的絕對數(shù)量均顯示出不同程度的短暫下降。NS7CAR迅速消滅了CD7+細(xì)胞，并主要保留了CD7陰性細(xì)胞亞群。T/B/NK細(xì)胞隨后恢復(fù)到基線水平，但就如所預(yù)期的，在移植后不久出現(xiàn)下降。在移植后，正常的CD7+T細(xì)胞和NK細(xì)胞得到充分恢復(fù)。
‖總結(jié)
該研究揭示了通過"自然選擇"機(jī)制生產(chǎn)靶向CD7 CAR-T細(xì)胞的方法(NS7CAR)。研究者發(fā)現(xiàn)，雖然流式無法檢測到NS7CAR-T細(xì)胞表面上的CD7分子，但NS7CAR-T細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)CD7mRNA和蛋白質(zhì)的水平雖然稍低，但與正常對照T細(xì)胞中的水平是可比的。研究認(rèn)為，NS7CAR-T細(xì)胞的CD7分子很可能被CD7CAR抗原掩蓋或在胞內(nèi)隔離，大大減少了NS7CAR-T的表面CD7抗原，避免了CAR-T細(xì)胞之間的大量自相殘殺。不能排除在體外"自然選擇"過程中，少部分NS7CAR-T細(xì)胞從自相殘殺中出現(xiàn)的可能性。這使得NS7CAR-T與真正的CD7陰性的Neg7CAR-T或KO7CAR-T細(xì)胞形成對比。研究者提出，許多NS7CAR-T細(xì)胞本身并不是CD7陰性，而是功能性CD7陰性。
因此，研究者提出假設(shè)：由于CAR信號可能需要蛋白質(zhì)復(fù)合物形成，CAR-T細(xì)胞通過NS7CAR-T細(xì)胞表面的游離CD7CAR與靶向T細(xì)胞上表達(dá)的CD7之間的相互作用被激活，而胞內(nèi)CD7-CD7CAR復(fù)合物不能激活T細(xì)胞。與Neg7CAR和KO7CAR細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)CD7CAR-CD7相互作用是否導(dǎo)致CAR信號減弱,并導(dǎo)致NS7CAR細(xì)胞體外擴(kuò)增程度降低仍待確定。其次，自相殘殺是否在NS7CAR減少擴(kuò)增中發(fā)揮了作用還有待進(jìn)一步研究。
在NS7CAR中，存在顯著更多的CD8+中央記憶CAR-T細(xì)胞，這種CD8偏向性可能提供更持久的疾病控制。由于NS7CAR的產(chǎn)生不涉及額外的基因編輯，避免了脫靶效應(yīng)的潛在風(fēng)險。因此，NS7CAR的生物學(xué)特性和其生產(chǎn)的便捷十分有利于其臨床應(yīng)用。
迄今為止，針對T細(xì)胞惡性血液腫瘤的靶向CD7 的CAR-T療法僅有有限的臨床試驗和病例報告。NS7CAR可由患者或供者的外周血制備，中位轉(zhuǎn)染率大于95%，且細(xì)胞活性率約90%。由T系惡性血液腫瘤患者制備的自體CAR-T細(xì)胞的主要安全顧慮是細(xì)胞終產(chǎn)品中的惡性細(xì)胞污染。根據(jù)每個患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表型，使用CD3或CD4/CD8選擇加上NS7CAR的體外 "自然選擇 "以及強(qiáng)大的抗白血病活性，可以成功地排除NS7CAR制備中的惡性細(xì)胞。
在該臨床試驗中，幾乎所有患者在第28天時都達(dá)到了MRD陰性的CR。大部分有髓外病灶的患者，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者或彌漫性髓外受累的患者，也都能達(dá)到髓外CR。兩名有巨大縱膈腫塊的患者分別達(dá)到了PR和SD。對于有巨大腫塊的患者來說，可能需要更長的時間及聯(lián)合治療來實現(xiàn)CR，因為根據(jù)PET-CT評估，處于PR的患者在第104天發(fā)現(xiàn)有進(jìn)一步的臨床改善。
入組該臨床試驗的患者曾接受了大量的既往治療。鑒于CD19 CAR-T治療的B-ALL患者復(fù)發(fā)率較高，而且T-ALL/LBL比一般B-ALL更具侵略性，該研究允許在緩解后進(jìn)行鞏固性異基因造血干細(xì)胞移植。共有10名骨髓和髓外CR患者進(jìn)行了鞏固性異基因造血干細(xì)胞移植，這可能限制對于NS7CAR-T單藥治療的持續(xù)性的評估。盡管如此，在中位隨訪時間超過4.5個月（最長10個月）的情況下，NS7CAR回輸后再進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植組沒有觀察到復(fù)發(fā)現(xiàn)象。在6名沒有接受移植的CR患者中，有4名在最后一次隨訪時仍保持CR（中位時間1.5個月，最長6個月）。然而，在一些未達(dá)到CR或復(fù)發(fā)的患者中，觀察到CD7靶點丟失。
STIL-TAL1融合基因與較高的復(fù)發(fā)率和較差的預(yù)后有關(guān)，發(fā)生在高達(dá)約25%的T-ALL患者中。在這一研究中，所有3名STIL-TAL1融合基因的患者預(yù)后都較差，有1名NR和2名早期復(fù)發(fā)，表明單獨使用CAR-T療法可能無法扭轉(zhuǎn)其臨床結(jié)局。一旦這類患者從CAR-T中獲得CR，應(yīng)在治療過程的早期考慮進(jìn)行移植。
NS7CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增在中位第19天達(dá)到峰值，截至最后一次隨訪時，可檢測到NS7CAR-T細(xì)胞持續(xù)存在長達(dá)195天。12/14名患者在移植后中位隨訪時間1.2個月（最長4.9個月）時，仍可通過qPCR檢測到低水平的NS7CAR-T。
NS7CAR表現(xiàn)出卓越的安全性，在大多數(shù)患者中只有輕微的CRS，沒有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性。在該臨床研究方案中，早期應(yīng)用托珠單抗干預(yù)管理，有可能降低嚴(yán)重CRS的發(fā)生。這種早期干預(yù)和管理可能在減少CRS方面發(fā)揮了作用。
兩名曾有異基因造血干細(xì)胞移植史的患者在回輸時使用了來自移植供者的CAR-T細(xì)胞，其中一位出現(xiàn)了輕微的皮膚排異反應(yīng)。因此，應(yīng)特別關(guān)注此類患者。14名患者中有7名接受了后續(xù)的異基因造血干細(xì)胞移植，包括其中2名第二次移植的患者出現(xiàn)了GvHD。雖然在這7名回輸后出現(xiàn)GvHD的患者中仍可檢測到極低水平的CAR-T細(xì)胞，但是不太可能是導(dǎo)致GvHD的原因。
小結(jié)
在該研究中，NS7CAR在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤作用。NS7CAR的首次人體臨床試驗表明，無需額外的基因編輯即可防止CD7表達(dá)，并成功生產(chǎn)NS7CAR-T細(xì)胞。總體而言，NS7CAR對治療R/R T-ALL/LBL是安全且高效的。
